Olink NextSeq 550 Explore Sequencing Manuale dell'utente

Olink® Explore è una piattaforma di immunodosaggio multiplex per la scoperta di biomarcatori proteici umani. Il prodotto è destinato esclusivamente a scopi di ricerca e non per l'uso in procedure diagnostiche. Il lavoro di laboratorio deve essere eseguito solo da personale di laboratorio addestrato. Il trattamento dei dati sarà effettuato solo da personale addestrato. I risultati sono pensati per essere utilizzati dai ricercatori insieme ad altri risultati clinici o di laboratorio.

Informazioni su questo manuale

Questo Manuale dell'utente fornisce le istruzioni necessarie per sequenziare le librerie Olink® Explore su Illumina® NextSeq™ 550. Le istruzioni devono essere seguite rigorosamente ed esplicitamente. Eventuali deviazioni durante le fasi di laboratorio possono causare dati alterati. Prima di iniziare il flusso di lavoro del laboratorio, consultare Olink® Explore Overview Manuale dell'utente per un'introduzione alla piattaforma, comprese le informazioni sui reagenti, le attrezzature e la documentazione necessaria, un overview del flusso di lavoro, nonché linee guida di laboratorio. Per istruzioni su come eseguire i kit di reagenti Olink® Explore, fare riferimento al manuale dell'utente Olink® Explore applicabile. Per l'elaborazione dei dati e l'analisi dei risultati della sequenza Olink® Explore, fare riferimento al Manuale utente Olink® NPX Explore. Tutti i marchi e i diritti d'autore contenuti in questo materiale sono di proprietà di Olink® Proteomics AB, salvo diversa indicazione.

Supporto tecnico

Per il supporto tecnico, contattare Olink Proteomics all'indirizzo support@olink.com.

Istruzioni di laboratorio

Questo capitolo fornisce istruzioni su come sequenziare le librerie Olink su NextSeq™ 550 utilizzando NextSeq™ 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cicli). Il protocollo utilizzato per il sequenziamento è un adattamento del flusso di lavoro NGS standard Illumina® per Illumina® NextSeq™ 550. Prima di procedere al sequenziamento, accertarsi che la qualità della libreria purificata sia stata verificata. Fare riferimento al manuale dell'utente Olink Explore applicabile per istruzioni sul controllo di qualità.

Pianificare la corsa di sequenziamento

È possibile sequenziare una libreria Olink per cella a flusso NextSeq™ 550 High Output e per corsa. Il numero di celle a flusso ad alto rendimento e corse necessarie per sequenziare i diversi kit di reagenti Olink Explore è descritto nella Tabella 1. Se è necessaria più di una corsa, ripetere le istruzioni descritte in questo manuale.

Tabella 1. Pianificazione della corsa di sequenziamento

Kit di reagenti Olink® Explore	Numero di librerie Olink	Numero di celle a flusso e corse
Kit di reagenti Olink® Explore 384	1	1
Kit di reagenti Olink® Explore 4 x 384	4	4
Kit di reagenti Olink® Explore 1536	4	4
Kit di reagenti di espansione Olink® Explore	4	4
Kit di reagenti Olink® Explore 3072	8	8

Installa la ricetta personalizzata Olink®

Durante questa fase, la ricetta personalizzata Olink® viene installata su NextSeq™ 550. Questa fase deve essere eseguita solo una volta, prima che venga eseguita una corsa di sequenziamento Olink per la prima volta.

NOTA: La ricetta personalizzata Olink funzionerà solo con i kit NextSeq™ 500/550 High Output e NextSeq™ Control Software 4.0.

Decomprimere e posizionare la ricetta personalizzata Olink Olink_NSQ550_HighOutput_V1 nella seguente cartella dello strumento NextSeq™ 550: C:\Program Files\Illumina\NextSeq Control Software\Ricetta\Personalizzata\Alta\.

In Personalizzazione del sistema > Gestisci strumento, abilita Ricette personalizzate. Se non selezionata, l'opzione della ricetta personalizzata non verrà visualizzata durante l'impostazione della corsa.

NOTA

Nella versione del software NCS 4.0, l'opzione per selezionare una ricetta personalizzata si verificherà solo dopo che la cartuccia di reagenti è stata caricata, non nella pagina di configurazione precedente.

La corsa deve essere impostata in modalità manuale per consentire ricette personalizzate.

Preparare i reagenti di sequenziamento

Durante questa fase, la cartuccia di reagenti contenente i reagenti di clustering e sequenziamento viene scongelata e viene preparata la cella a flusso.

Preparare la cartuccia del reagente

AVVERTIMENTO: La cartuccia di reagenti contiene sostanze chimiche potenzialmente pericolose. Indossare dispositivi di protezione adeguati e smaltire i reagenti usati in conformità con gli standard applicabili. Per ulteriori informazioni, fare riferimento alla Guida del sistema Illumina NextSeq 550 (documento n. 15069765).

Prepara la panca

1x NextSeq™ 500/550 High Output Reagent Cartridge v2 (75 cicli).

Istruzioni

Immergere la cartuccia di reagenti congelata per metà in acqua a temperatura ambiente e lasciarla scongelare per 1 ora. Assicurarsi che tutti i serbatoi dei reagenti delle cartucce siano completamente scongelati.
- NOTA: Per comodità, scongelare la cartuccia il giorno prima e conservarla tutta la notte a 4 °C. A questa temperatura, i reagenti sono stabili fino a una settimana.

Asciugare accuratamente la base della cartuccia con un tovagliolo di carta e, se necessario, asciugare le guarnizioni in alluminio con un fazzoletto privo di lanugine.
Capovolgere la cartuccia dieci volte per miscelare accuratamente i reagenti scongelati all'interno.

Picchiettare delicatamente la cartuccia sul banco per rimuovere le bolle d'aria. Conservare la cartuccia a temperatura ambiente se verrà utilizzata entro 4 ore.

Preparare la cella a flusso

Prepara la panca

1 cella a flusso ad alto rendimento NextSeq™ 500/550 v2.5.

Istruzioni

Portare la cella a flusso refrigerata a temperatura ambiente per 30 minuti.

Indossare nuovi guanti senza polvere (per evitare di contaminare la superficie di vetro della cella a flusso).
Quando si è pronti per caricare la cella a flusso nello strumento, rimuovere la cella a flusso dalla confezione e il guscio di plastica.

Ispezionare la cella a flusso. Se particolato o polvere sono visibili su una qualsiasi delle superfici in vetro, pulire la superficie applicabile con una salvietta priva di lanugine con alcool isopropilico e asciugarla con un fazzoletto da laboratorio a bassa lanugine.

Preparare la libreria Olink® per il sequenziamento

Durante questa fase, vengono preparate le diluizioni di NaOH e Tris-HCl e la libreria Olink purificata e di qualità controllata viene diluita e denaturata in passaggi sequenziali.

Preparare la diluizione NaOH

La diluizione NaOH viene utilizzata per denaturare le librerie.

Prepara la panca

Magazzino NaOH 1N
MilliQ acqua
1x provetta per microcentrifuga (1.5 ml)
Pipetta manuale (10–100 μL)
Puntali per pipette filtranti

Prima di iniziare

Contrassegnare la provetta per microcentrifuga "0.2 N NaOH".

Istruzioni

Preparare una diluizione NaOH 0.2 N nella provetta NaOH 0.2 N secondo la Tabella 2.
Agitare accuratamente la provetta NaOH da 0.2 N e centrifugare. Utilizzare entro 12 ore.

Tabella 2. Diluizione NaOH 0.2 N

Reagente	Volume (μL)
MilliQ acqua	80
Magazzino NaOH 1N	20

Preparare la diluizione Tris-HCl

La diluizione Tris-HCl viene utilizzata per neutralizzare la libreria denaturata.

Prepara la panca

1 M Tris-HCl pH 7.0 stock (soluzione di cloridrato Trizma®)
MilliQ acqua
1x provetta per microcentrifuga (1.5 ml)
Pipetta manuale (10–100 μL)
Puntali per pipette filtranti

Prima di iniziare

Contrassegnare la provetta per microcentrifuga "Tris-HCl"

Istruzioni

Preparare una diluizione Tris-HCl 200 mM nel tubo Tris-HCl secondo la tabella 3.
Agitare accuratamente la provetta Tris-HCl e ruotarla.

Tabella 3. Diluizione Tris-HCl 200 mM

Reagente	Volume (μL)
MilliQ acqua	80
Stock 1M Tris-HCl pH 7.0 (soluzione di cloridrato Trizma®)	20

Librerie Olink® diluite

Durante questa fase, la libreria Olink purificata e di qualità controllata viene diluita 1:33.

Prepara la panca

Lib Tube, preparato secondo il manuale utente Olink Explore applicabile
MilliQ acqua
1x provetta per microcentrifuga (1.5 ml)
Pipette manuali (0.5–10 e 100–1000 μL)
Puntali per pipette filtranti

Prima di iniziare

Scongelare il tubo Lib se congelato.
Contrassegnare la nuova provetta per microcentrifuga: "Dil".

Istruzioni

Aggiungere 96 μL di acqua MilliQ al tubo Dil.
Vortexare il tubo Lib e ruotarlo brevemente.
Trasferire 3 μL dal tubo Lib al tubo Dil.
Agitare il Dil Tube e ruotarlo brevemente.

NOTA: Conservare la(e) provetta(e) Lib a -20 °C in caso di potenziale ripetizione(e).

Denaturare e diluire Olink® Library fino alla concentrazione di caricamento finale

Durante questa fase, la libreria Olink diluita viene denaturata e ulteriormente diluita fino alla concentrazione di caricamento finale.

Prepara la panca

Dil Tube, preparato nel passaggio precedente
Diluizione di NaOH 0.2 N, appena preparata nel passaggio precedente
Diluizione 200 mM Tris-HCl (pH 7.0), preparata nel passaggio precedente
Tampone di ibridazione 1 (HT1) incluso in NextSeq™ Accessory Box v2
2 provette per microcentrifuga (1.5 ml e 2 ml)
Pipette manuali (0.5–10 e 100–1000 μL)
Puntali per pipette filtranti

Prima di iniziare

Scongelare il tampone HT1 congelato a temperatura ambiente. Conservare a +4 °C fino all'uso.
Contrassegnare la nuova provetta per microcentrifuga da 1.5 mL: "Den" (per la libreria denaturata).
Contrassegnare la nuova provetta per microcentrifuga da 2 mL: "Seq" (per la libreria pronta per il caricamento).

Istruzioni

Trasferire 5 μL dal tubo Dil al tubo Den.
Aggiungere 5 μL di 0.2 N NaOH al Den Tube.
Agitare il Den Tube e ruotarlo brevemente.
Incubare il Den Tube per 5 minuti a temperatura ambiente per denaturare la libreria.
Aggiungere 5 μL di 200 mM Tris-HCl (pH 7.0) al Den Tube per neutralizzare la reazione.

Agitare il Den Tube e ruotarlo brevemente.
Aggiungere 985 μL di prechilled HT1 al Den Tube.
Agitare il Den Tube e ruotarlo brevemente. La provetta può essere conservata a +4 °C fino all'utilizzo (lo stesso giorno).
Trasferire 205 μL dal Den Tube al Seq Tube.

Aggiungere 1095 μL di HT1 preraffreddato alla Seq Tube.
Capovolgere la Seq Tube per miscelare i reagenti e farla girare brevemente. Il volume di caricamento finale è di 1.3 ml.
Continuare immediatamente alla corsa di sequenziamento 2.5 Perform Olink®.

Eseguire la corsa di sequenziamento Olink®

Durante questa fase, la cartuccia del tampone, la cella a flusso e la cartuccia di reagenti preparata contenente la libreria Olink vengono caricate in NextSeq 550 e la corsa di sequenziamento viene avviata utilizzando la ricetta personalizzata Olink.

Prepara la panca

Seq Tube (con libreria pronta per il caricamento), preparato nel passaggio precedente
1x NextSeq™ 500/550 High Output Reagent Cartridge v2, preparata nel passaggio precedente
1 cella a flusso ad alto output NextSeq™ 500/550 v2.5, preparata nella fase precedente

1 cartuccia tampone NextSeq™ 500/550 v2 (75 cicli), a temperatura ambiente

Impostare i parametri della corsa di sequenziamento

Durante questa fase, i parametri della corsa di sequenziamento vengono selezionati su NextSeq™ 550.

Nella schermata iniziale di NextSeq™ 550, selezionare Esperimento.
Nella schermata Select Assay, selezionare Sequence.
Nella pagina Esegui installazione, selezionare Modalità di esecuzione manuale e quindi Avanti.

Impostare i parametri di esecuzione come segue:
- Nel campo Nome esecuzione, inserisci un ID esperimento univoco.
- Nel campo ID libreria, inserisci l'ID della libreria in esecuzione (facoltativo).
- Nel campo Tipo di lettura selezionare l'opzione Lettura singola.
- Immettere il numero di cicli come segue:
  - Leggi 1: 24
  - Indice 1: 0
  - Indice 2: 0
  - Leggi 2: 0
  - IMPORTANTE: È fondamentale che Read 1 sia impostato su 24, altrimenti l'intera esecuzione fallirà.
- Mantieni deselezionata la casella di controllo per i primer personalizzati.
- Imposta la posizione della cartella di output per i dati grezzi dell'esecuzione corrente. Selezionare Sfoglia per modificare il percorso della cartella di output.
Non impostare una Sample Foglio.
Selezionare Elimina i materiali di consumo per questa corsa.
Selezionare Avanti.

Caricare la cella a flusso in NextSeq™ 550

Rimuovere la cella a flusso usata dalla corsa precedente.
Posizionare la nuova cella a flusso preparata su stage.
Seleziona Carica. La porta si chiude automaticamente.
Quando l'ID della cella a flusso viene visualizzato sullo schermo e i sensori sono contrassegnati in verde, selezionare Avanti.

Svuotare il contenitore del reagente

AVVERTIMENTO: Questo set di reagenti contiene sostanze chimiche potenzialmente pericolose. Indossare dispositivi di protezione adeguati e smaltire i reagenti usati in conformità con gli standard applicabili. Per ulteriori informazioni, fare riferimento alla Guida del sistema Illumina NextSeq 550.

Aprire lo sportello dello scomparto del tampone, rimuovere il contenitore dei reagenti usati dallo scomparto inferiore e smaltire il contenuto in conformità con gli standard applicabili.
Reinserire il contenitore del reagente vuoto nello scomparto inferiore del tampone. Un clic udibile indica che il contenitore è posizionato correttamente.

Caricare la cartuccia tampone

Rimuovere la cartuccia del tampone usata dallo scomparto superiore del tampone e smaltire il contenuto in conformità con gli standard applicabili.

Far scorrere una nuova cartuccia tampone nello scomparto superiore del tampone. Un clic udibile indica che la cartuccia è posizionata correttamente. Assicurarsi che l'ID della cartuccia tampone appaia sullo schermo e che i sensori siano contrassegnati in verde.
Chiudere lo sportello del vano tampone e selezionare Avanti.

Caricare la cartuccia del reagente

Aprire lo sportello dello scomparto dei reagenti, rimuovere la cartuccia di reagenti usata e smaltire il contenuto inutilizzato in conformità con gli standard applicabili. Il serbatoio in posizione 6 è rimovibile per facilitare lo smaltimento sicuro.

Forare il sigillo del serbatoio n. 10 etichettato come "Load Library Here" con una punta di pipetta pulita da 1 mL.
Caricare 1.3 mL della libreria Olink dalla provetta Seq nel serbatoio n. 10 etichettato come "Carica libreria qui".
Far scorrere la nuova cartuccia di reagenti nello scomparto dei reagenti e chiudere lo sportello dello scomparto dei reagenti.

Selezionare Carica e attendere circa 30 secondi finché l'ID della cartuccia di reagenti non viene visualizzato sullo schermo e i sensori sono contrassegnati in verde.
Dall'elenco a discesa Ricetta, selezionare l'opzione ricetta [Personalizzato] "Olink_NSQ550_HighOutput_V1".
- IMPORTANTE: Assicurarsi che la ricetta personalizzata sia stata precedentemente installata nello strumento. Fare riferimento a 2.2 Installare la ricetta personalizzata Olink®.

Selezionare Avanti.

Avvia la corsa di sequenziamento

Confermare i parametri di corsa visualizzati sul Review schermo. Per modificare qualsiasi parametro, premere Indietro per tornare alla schermata Run Setup.
Seleziona Avanti. La corsa inizia dopo un controllo automatico prima della corsa. Il tempo di esecuzione del sequenziamento è di circa 7h30 min.
IMPORTANTE: Assicurarsi che la corsa inizi quando il controllo automatico pre-corsa è stato completato (~5 minuti).
1. NOTAPer eventuali errori di controllo pre-corsa, fare riferimento alle istruzioni del produttore.
2. NOTA: Fare attenzione a non urtare o disturbare in altro modo NextSeq™ 550 durante la corsa di sequenziamento. Lo strumento è sensibile alle vibrazioni.
Pulisci l'area di lavoro.
1. NOTA: Al termine della corsa di sequenziamento, il software avvia un lavaggio automatico post-corsa utilizzando le soluzioni di lavaggio fornite nella cartuccia del tampone e l'NaOCl fornito nella cartuccia del reagente. Questo lavaggio richiede circa 90 minuti. Il pulsante Home diventa attivo una volta completato il lavaggio. Le cartucce e la cella a flusso usate possono essere lasciate in posizione fino alla corsa successiva.

Monitorare l'avanzamento della corsa

Olink utilizza NGS come lettura per quantificare la quantità di una sequenza nota al fine di stimare la concentrazione di una data proteina in samples (rispetto ad altri samples). La qualità dei dati di ciascuna corsa di sequenziamento Explore è determinata principalmente dai parametri QC esclusivi della tecnologia Olink. Pertanto, le metriche di controllo qualità standard utilizzate nell'NGS convenzionale, come il Q-score, sono meno critiche.

Cronologia delle revisioni

Versione	Data	Descrizione
1.2	Numero di telefono: 2022-11-01	1.2 Sostituito Olink® Mydata con Olink® NPX Explore. 2.4 Aggiunti 0.2 N a Prima di iniziare.
1.1	Numero di telefono: 2021-12-13	Modifiche editoriali
1.0	Numero di telefono: 2021-12-01	Nuovo

www.olink.com

Solo per uso di ricerca. Non per l'uso nelle procedure diagnostiche.

Questo prodotto include una licenza per l'uso non commerciale dei prodotti Olink. Gli utenti commerciali potrebbero richiedere licenze aggiuntive. Si prega di contattare Olink Proteomics AB per i dettagli. Non ci sono garanzie, espresse o implicite, che si estendono oltre questa descrizione. Olink Proteomics AB non è responsabile per danni alla proprietà, lesioni personali o perdite economiche causate da questo prodotto. Il seguente marchio è di proprietà di Olink Proteomics AB: Olink®. Questo prodotto è coperto da numerosi brevetti e domande di brevetto disponibili su https://www.olink.com/patents/.

© Copyright 2021 Olink Proteomics AB. Tutti i marchi di terze parti sono di proprietà dei rispettivi proprietari.
Olink Proteomics, Dag Hammarskjölds väg 52B , SE-752 37 Uppsala, Svezia
1192, v1.2, 2022-11-01

Documenti / Risorse

Olink NextSeq 550 Esplora il sequenziamento [pdf] Manuale d'uso
NextSeq 550 Esplora sequenziamento, NextSeq 550, Esplora sequenziamento, Sequenziamento

Riferimenti

Manuale d'uso

Olink NextSeq 550 Esplora il sequenziamento

Nota documento

Introduzione

Istruzioni di laboratorio

Preparare la cartuccia del reagente

Preparare la cella a flusso

Prima di iniziare

Librerie Olink® diluite

Denaturare e diluire Olink® Library fino alla concentrazione di caricamento finale

Eseguire la corsa di sequenziamento Olink®

Svuotare il contenitore del reagente

Cronologia delle revisioni

Documenti / Risorse

Riferimenti

Lascia un commento

Annulla risposta